Comunicação entre vírus

No texto de hoje vou falar sobre um trabalho publicado em janeiro de 2017 que tem como tema principal a interação de vírus (bacteriófagos) com seus hospedeiros (bactérias). O trabalho teve início quando os autores resolveram procurar por moléculas bacterianas que serviriam de alerta para presença dos vírus, já que a hipótese original era que bactérias infectadas poderiam liberar algum tipo de sinalizador no meio que serviria como aviso para bactérias não infectadas de que haveriam vírus por ali. Depois dos primeiros experimentos foi visto que estas supostas moléculas bacterianas não existiam neste contexto, mas algo ainda mais surpreendente foi encontrado! Resolvi escrever sobre isto por dois motivos: primeiro porque o trabalho é muito interessante e gera novas ideias para quem gosta de vírus e biologia em geral, e segundo porque ele não é tão diferente do que tenho feito ultimamente em um dos meus projetos (guardadas as proporções dos modelos utilizados e hipóteses).

Então antes de qualquer coisa: vocês devem ter reparado que mencionei acima a busca por moléculas bacterianas que serviriam para transmitir avisos entre elas. Em outras palavras, um sistema de comunicação química entre microrganismos. Comunicação pode ser definida como “… troca de informação por fala, escrita, ou uso de outro meio[1], então se uma bactéria envia sinais moleculares para avisar outra sobre alguma situação está havendo algum tipo de comunicação entre elas. Comunicação entre microrganismos pode até parecer um fenômeno difícil de acreditar, mas ocorre em vários grupos de bactérias e é chamado de quorum sensing. O quorum sensing bacteriano regula processos cooperativos diversos como produção de luz em simbiontes, migração de bactérias aquáticas, formação de biofilme, produção de fatores de virulência, secreção de enzimas e até mesmo proteção contra bacteriófagos [2,3]. De uma forma bem simplificada, o quorum sensing funciona assim: pequenas moléculas são produzidas e secretadas pelas bactérias, indo para meio ambiente e sendo difundidas, degradadas ou reabsorvidas por elas. Quanto mais bactérias presentes mais moléculas sinalizadoras são produzidas ao mesmo tempo, o que aumenta a chance delas serem reabsorvidas em grande quantidade. Quando estas moléculas atingem uma concentração crítica dentro das células elas passam a ativar (ou desativar) funções celulares que regulam os processos mencionados acima [2]. Então de uma forma geral o quorum sensing bacteriano permite que bactérias ajustem seu comportamento de acordo com a densidade populacional de suas comunidades, sincronizando respostas biológicas de acordo com o número de indivíduos presentes.

Voltando agora para o assunto do artigo mencionado no primeiro parágrafo: no trabalho foram utilizadas bactérias da espécie Bacillus subtilis e o bacteriófago phi3T (Figura 1), capaz de infectá-las. Estas bactérias são utilizadas em laboratórios (de modelo experimental para bactérias gram positivas a doadoras de genes para milho transgênico resistente à seca) e são encontradas na natureza como parte da microbiota do solo e do intestino humano [4]. Já estes vírus são conhecidos há muito tempo, possuem aquela estrutura complexa tradicional de muitos bacteriófagos (Figura 1) e quando infectam uma bactéria podem tomar dois caminhos distintos: lise ou lisogenia [5]. A lise é o resultado de uma infecção produtiva onde o vírus encontra seu alvo, injeta seu genoma na célula, passa por todas as etapas necessárias de replicação e termina destruindo a célula infectada para liberação de várias partículas virais. Já a lisogenia ocorre quando o vírus encontra seu alvo, injeta seu genoma na célula e, ao invés do genoma passar pelas etapas necessárias para produção de novos vírus, ele é inserido no genoma bacteriano e passa a fazer parte do material genético do hospedeiro. Quando a lisogenia ocorre a célula bacteriana não morre e novos vírus não são produzidos, então a bactéria pode continuar se multiplicando dando origem a novas bactérias que carregam o genoma do vírus. Após varias gerações ou certos estímulos, como stress ambiental ou falta de nutrientes, o DNA viral inserido no genoma bacteriano pode ser reativado para dar inicio a infecções líticas. A regulação destes processos (tanto lise/lisogenia quanto reativação de lisogênicos) não é completamente conhecida ainda, e decisões probabilísticas influenciadas pelo estado nutricional da célula e número de partículas são consideradas importantes [6].

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Figura 1: Imagens e representações esquemáticas do vírus phi3T (A e B) e da bactéria Bacillus subtilis (C a E). Em A uma representação esquemática da morfologia da partícula viral e em B uma imagem de microscopia eletrônica mostrando algumas partículas reais. Em C colônias de B. subtilis (cada uma com poucos milímetros de diâmetro). Em D B. subtilis corados pela coloração de gram (a barra de escala representa 0.00001 metros).  Em E uma imagem de microscopia eletrônica mostrando o corte de um B. subtilis (a barra de escala representa 0.0000002 metros).

Créditos das imagens:

A) http://viralzone.expasy.org/all_by_protein/790.html

B) https://www.unil.ch/dmf/en/home/menuinst/research-units/moreillon/former-collaborators/vladimir-lazarevic.html

C)https://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis#/media/File:Bacillus_subtilis_colonies.jpg

D) https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=49528

E) https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=4487608

Para procurar por moléculas de comunicação entre bactérias os pesquisadores infectaram culturas de Bacillus subtilis com phi3T, esperaram algumas horas e depois filtraram as culturas. Fazendo isto eles removeram todas as bactérias e todos os vírus presentes, ficando apenas com o meio de cultura condicionado (contendo pequenas moléculas produzidas durante a interação do vírus com o hospedeiro). Este meio condicionado foi então adicionado a novas culturas de bactérias com vírus, e o que se viu foi que ele protegia as células bacterianas da infecção (havia mais células vivas nas culturas com meio condicionado do que nas culturas controle). Outros experimentos mostraram que o componente do meio condicionado responsável pela proteção das bactérias era um pequeno peptídeo (molécula proteica), e que as bactérias protegidas estavam passando por infecções lisogênicas no lugar de infecções líticas. Ou seja: de alguma forma bactérias infectadas liberam peptídeos que, ao serem absorvidos por bactérias não infectadas, as protegem de uma infecção lítica (e consequentemente da morte) por favorecer o acontecimento de infecções lisogênicas [7,8]. A princípio isto pode parecer exatamente o que se estava procurando (sinais de perigo emitidos por células infectadas), mas a grande surpresa foi a origem deste pequeno peptídeo que favorece as infecções lisogênicas. Ao se buscar pela origem do peptídeo descobriu-se que ele não era bacteriano, mas sim codificado pelo próprio vírus!

O fago phi3T já era conhecido há mais de 40 anos mas até então não havia sido completamente sequenciado (o que mostra o tão pouco que sabemos sobre vírus, mesmo dos que já conhecemos há muito tempo). Neste trabalho o genoma foi sequenciado, resultando em uma sequência de 128.000 bases (A-T-C-G, componentes do DNA) com um total de 201 genes preditos. Utilizando bioinformática, os pesquisadores descobriram que três destes 201 genes possuíam peptídeo-sinal (indicação que seus produtos são secretados ou localizados na membrana), e dentre estes três um era semelhante a um gene usado em quorum sensing de Bacillus. Este gene codifica uma proteína que quando processada resulta em um pequeno peptídeo com a sequência de aminoácidos SAIRGA (serina-alanina-isoleucina-arginina-glicina-alanina, componentes de proteínas). Análises de espectrometria de massa mostraram que o peptídeo SAIRGA é encontrado em grande quantidade em amostras infectadas, e quando ele foi sintetizado e adicionado a culturas de bactérias infectadas se mostrou que ele é o responsável por favorecer a lisogenia protegendo as bactérias de lise e morte de forma dose-dependente [8]. Resumindo: durante uma infecção de Bacillus por phi3T um pequeno peptídeo de sequencia SAIRGA codificado pelo genoma viral é produzido e se acumula no meio. Ao atingir doses elevadas, ele atua favorecendo o desenvolvimento de infecções lisogênicas, influenciando então na “decisão” viral entre lise ou lisogenia. De uma certa forma ele serve como um meio de comunicação entre gerações passadas com a geração atual de vírus, deixando claro que já houveram muitas infecções líticas e morte bacteriana no passado. Por causa desta influencia na decisão entre lise e lisogenia, o peptídeo foi chamado de arbitrum (palavra em latim que significa decisão).

Análises mais detalhadas do mecanismo por trás da comunicação por arbitrum mostraram que ele depende de três genes virais. Um que codifica o peptídeo arbitrum (aimP); outro que codifica uma proteína que se liga ao arbitrum e que também é  capaz de se ligar ao DNA viral (aimR) se não estiver com arbitrum por perto; e um terceiro gene (aimX) que é ativado quando aimR está ligado ao DNA. O que acontece em uma infecção então é: aimR é produzido e por não existir arbitrum no interior da célula ela se liga ao DNA viral e ativa o gene aimX (que tem como função inibir a lisogenia ou promover infecções líticas). O gene aimP também é produzido, secretado e no exterior das células o peptídeo arbitrum vai se acumulando. Então durante os primeiros ciclos de infecção arbitrum vai se acumulando e existe uma tendência para que ocorram infecções líticas por causa da atividade de aimX. Entretanto, com o passar do tempo a quantidade de arbitrum atinge níveis críticos que passam a se ligar a aimR o fazendo soltar do DNA viral, o que inibe a produção de aimX e consequentemente inibe a tendência em ocorrer infecções líticas [8]. A partir deste momento, quando muito arbitrum está presente no meio e muitas bactérias já morreram, a tendência passa a ser infecções lisogênicas, o que não mata mais bactérias e garante que a população de hospedeiros não seja extinta (nem a população do vírus, que permanece inserido no genoma bacteriano). Foi mostrado que o sistema descrito acima não é o único determinante para decisão entre lise e lisogenia, já que a taxa de lisogenia é de 18% sem arbitrum e passa a ser de 48% com ele. Portanto, o sistema serve para otimizar esta decisão de acordo com a quantidade de infecções passadas, mas ainda depende de fatores estocásticos (aleatórios) e outros ainda desconhecidos.

Este é o primeiro sistema de comunicação entre vírus descrito. Não é difícil imaginar as pressões seletivas que o fizeram surgir evolutivamente. Primeiramente os genes envolvidos se assemelham a sistemas de comunicação entre os hospedeiros do vírus, então existe a chance de terem sido adquiridos por transmissão gênica horizontal e modificados (apesar de poderem ter aparecido independentemente também, o que não é raro, como no caso de sistemas mais complexos como olhos em animais [9]). Quando uma população susceptível de hospedeiros é encontrada, um vírus se beneficia ao infectar e matar estes hospedeiros eficientemente, deixando uma grande quantidade de progênie. Entretanto, se todos os hospedeiros forem mortos, existe a chance do vírus também se extinguir caso não existam outras populações susceptíveis por perto. Sinais que mostrem para o vírus que já houve muita morte de hospedeiros por perto e que ao mesmo tempo limitem a destruição causada pelas infecções podem ajudar a manter os hospedeiros (e consequentemente os vírus) vivos. No caso do sistema arbitrum o que acontece é que uma população viral com tendência a infecções líticas passa a ter tendências lisogênicas quando já houve muita morte de hospedeiros no passado, tornando o vírus dormente e deixando a população de hospedeiros se recuperar antes dos próximos eventos líticos.

Análises de bioinformática encontraram sistemas similares ao sistema arbitrum em 112 outros vírus, todos também relacionados a bactérias do gênero Bacillus, cada um com sua sequencia peptídica única. Ou seja: cada vírus tem seu próprio peptídeo para comunicação o que torna os sinais específicos, como se cada um estivesse transmitindo em frequências diferentes e só captando o que foi emitido por seus similares. O fato deste sistema não ter sido encontrado em outros vírus não significa que eles não possuam formas de comunicação. Significa apenas que os sistemas podem ser diferentes e portanto precisam ser procurados com mais cuidado. Moléculas pequenas como o arbitrum são normalmente perdidas nos métodos tradicionais de análises biológicas, e os vírus possuem uma quantidade enorme de material genético com função ainda desconhecida [10]. Então é muito provável que novos sistemas de comunicação serão encontrados no futuro no meio de toda esta matéria negra viral (sequências com função desconhecida). Sistemas estes que regulem os processos de lise ou lisogenia e também muitos outros processos não relacionados a eles, em vírus ambientais, bacteriófagos e até mesmo em vírus que causam doenças em humanos.

As possíveis aplicações para o conhecimento de sistemas de comunicação viral são muitas. No caso de bacteriófagos existe a possibilidade de se modular a frequência de lise ou lisogenia, e isto pode ser explorado em processos biotecnológicos que usem fagos e até mesmo para saúde. Por exemplo: este tipo de comunicação pode ser utilizado para se otimizar ou controlar processos de fagoterapia (uso de fagos para tratamento de doenças bacterianas, seja em pacientes ou em produtos). Vírus mutantes com aplicação biotecnológica podem ser produzidos com sistemas de comunicação modificados ou deletados, resultando em vírus com atividades biológicas alteradas.  Existe também a possibilidade de doenças virais humanas serem controladas por mecanismos similares, como em casos onde a quantidade de células mortas por ciclos anteriores possa ser “sentida” através mediadores químicos virais, regulando a forma em como o vírus vai se comportar nos próximos ciclos de infecção. Ou até mesmo a regulação de processos que envolvam decisão entre infecções produtivas e a integração de HIV (quando o vírus insere seu genoma em células humanas, de forma parecida com a lisogenia de fagos) ou a latência de Herpesvirus (quando o vírus fica presente nas células humanas sem se replicar, podendo reaparecer anos depois). Caso existam sistemas de comunicação viral envolvidos nestes processos o potencial biotecnológico e clínico é enorme, e seu estudo resultaria em melhor entendimento das doenças e em novos métodos para tratamento. Afinal sistemas de comunicação quando conhecidos podem ser explorados, e problemas de comunicação quando gerados trazem complicações para quem está se comunicando [11].

O que acharam do texto? Dúvidas, críticas ou sugestões? Comentem abaixo que responderemos!

Referências:

[1] https://www.google.fi/webhp?sourceid=chrome-instant&ion=1&espv=2&ie=UTF-8#q=communication

[2] https://academic.oup.com/femsre/article-lookup/doi/10.1093/femsre/fuw038

[3] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3624510/

[4] https://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis

[5] http://viralzone.expasy.org/all_by_protein/790.html

[6] http://www.nature.com/nrmicro/journal/v13/n10/full/nrmicro3527.html

[7] http://www.nature.com/news/do-you-speak-virus-phages-caught-sending-chemical-messages-1.21313

[8] http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature21049.html

[9] https://www.amazon.co.uk/Climbing-Mount-Improbable-Richard-Dawkins/dp/0141026170

[10] https://elifesciences.org/content/4/e08490

[11] https://en.wikipedia.org/wiki/Communication_Breakdown

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Sofrimento animal e a linha tênue entre o que é ético e o que é conveniente para nós humanos

Antes de tudo desculpem pelo texto grande! Comecei a escrevê-lo com o foco na questão da Santa Cruz (contada no parágrafo abaixo) e depois achei melhor aproveitar o tema para expandir as discussões sobre ele. Então tenham paciência e leiam até o fim!

Em maio, uma notícia me chamou a atenção: a empresa americana Santa Cruz Biotech (http://www.scbt.com/) foi multada em 3,5 bilhões de dólares acusada de violações dos direitos dos animais [1,2]. Quem não está acostumado com certas áreas de pesquisa deve estar se perguntando: o que uma empresa de biotecnologia tem a ver com violação de direitos dos animais? A resposta neste caso está na produção de anticorpos. Como parte do sistema imunológico, os anticorpos são moléculas cuja função é reconhecer e se ligar a alvos específicos, tornando estes alvos então neutralizados e/ou marcados para etapas posteriores da resposta imune. A alta especificidade das porções variáveis dos anticorpos aliada a suas porções conservadas os tornam bastante úteis em pesquisa, já que alvos específicos podem ser reconhecidos pela primeira e os anticorpos contra este alvo especifico são reconhecidos pela segunda (quem estiver interessado em maiores detalhes pode dar uma olhada na Figura 1 abaixo).

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Figura 1: Em (a) uma representação esquemática de um anticorpo mostrando suas duas porções variáveis (variable region) responsáveis pela detecção do antígeno e sua porção conservada (constant chain). Em (b) uma representação de como os anticorpos podem ser utilizados em pesquisa. O antígeno, representado em verde, é reconhecido pelas porções variáveis de um anticorpo específico produzido contra ele. A presença do complexo antígeno-anticorpo é reconhecida por um segundo anticorpo capaz de reconhecer a porção conservada do primeiro. Este segundo anticorpo carrega um marcador em sua própria porção conservada, responsável por emitir algum tipo de sinal mostrando que o complexo [antígeno desejado + anticorpo primário] estava presente (ou nada é detectado, mostrando que não havia o antígeno desejado ali). Em (c) um exemplo prático mostrando células com DNA corado de vermelho e proteínas virais detectadas por um anticorpo que emite luz verde. O quadro da esquerda mostra células não infectadas (sem vírus, logo sem emissão de luz verde) enquanto o da direita mostra células infectadas (com a presença do vírus detectada indiretamente pela luz verde emitida pelo anticorpo secundário que reconheceu o anticorpo primário que estava ligado ao vírus).

Os anticorpos são comumente utilizados em vários tipos de pesquisa e aplicações: determinação da localização celular de proteínas (da própria célula ou não, como na Figura 1c) ; detecção de proteínas em amostras diversas (como por exemplo para diagnósticos) ; neutralização de alvos específicos e muitas outras aplicações. Os anticorpos utilizados em pesquisa podem ser policlonais (anticorpos diferentes que reconhecem um mesmo antígeno) ou monoclonais (anticorpos idênticos que reconhecem o mesmo antígeno), cada um com suas vantagens e desvantagens em relação a aplicações. As formas tradicionais de se produzir estes tipos de anticorpos diferem entre si, mas em ambos os casos animais de laboratório (normalmente camundongos, ratos, coelhos e bodes) precisam ser inoculados com o antígeno para o qual os anticorpos deverão se ligar. Depois da inoculação os animais precisam ser mantidos nos laboratórios tempo suficiente para que a resposta imune ocorra [3]. Durante este tempo os animais normalmente recebem mais doses do antígeno e passam por coleta de soro periódica, sendo que o processo completo pode durar meses [4].  As empresas que produzem anticorpos precisam então lidar com a preparação de antígenos, manutenção de animais (inoculados ou não) e seu sacrifício para obtenção do produto final. Não são tarefas fáceis, existem muitas regulações a serem seguidas, e a recompensa é participar de um nicho de mercado bilionário.

O catálogo de anticorpos da Santa Cruz possui mais de 70.000 anticorpos diferentes (20.000+ monoclonais e 51.000+ policlonais) [5]. Seus produtos são utilizados por laboratórios de todo o mundo, e certamente contribuíram para o avanço de várias áreas da pesquisa básica e aplicada. Como a empresa está situada nos EUA, era de se esperar que o rigor com controle de qualidade e na atenção com as regulações relacionadas a cuidados com os animais deveriam ser grande. Mas parece que este não é o caso. Lembro-me de precisar comprar anticorpos durante meu doutorado sanduíche, e meu chefe recomendou que não utilizássemos os produtos da Santa Cruz. Pensei que era uma peculiaridade dele, mas hoje vejo que na verdade reclamações em relação à qualidade dos produtos são frequentes [6,7]. Acusações de violações dos direitos dos animais, e multas por elas, não são novas para a Santa Cruz. Existem relatos de animais encontrados doentes, com mordidas de cobras ou coiotes, de galpões cheios de animais não declarados durante as fiscalizações e até mesmo de milhares de animais desaparecendo dos registros [8,9,10]! A empresa declarou que “não admite nem nega” as violações dos direitos dos animais.

A multa recebida é a maior já dada pelo Departamento de Agricultura dos EUA para este tipo de crime, e junto com a maior divulgação do caso pode ajudar a mudar a forma anti-ética de se pensar em cortar custos para obter mais lucro. Acredito que a grande maioria de quem ficou sabendo deste caso, ou que está lendo sobre ele neste texto agora, concorda que as atitudes da empresa são um absurdo e que ela mereceu a punição. Alguns pesquisadores já consideram não comprar mais produtos da empresa, o que pode trazer problemas de reprodutibilidade em experimentos a curto/médio prazo, mas que certamente mostra uma preocupação com ética em pesquisa [1,8]. A tendência de boicotar empresas que agem fora de certos padrões éticos não é novidade e acontece em vários segmentos, como nos boicotes a marcas de roupas que supostamente usam trabalho escravo ou a chocolates que supostamente usam cacau extraído por mão de obra infantil. Mas o boicote completo a produtos gerados com o uso de animais é praticamente impossível. Claro que alguns produtos como cosméticos podem deixar de ser usados sem problemas para a população, mas outros como medicamentos ou vacinas ou procedimentos médicos são essenciais e dificilmente, imagino, alguém se recusando a usá-los porque seu desenvolvimento causou sofrimento a animais de laboratório.

Após ler sobre o caso da Santa Cruz resolvi escrever aqui questionando até onde é “correto” causar sofrimento para um animal em troca de vantagem para um humano. Quando o assunto é uso de animais em pesquisa as opiniões divergem muito, indo de pessoas que defendem o uso indiscriminado de animais tendo como justificativa um bem maior para a humanidade até pessoas que são totalmente contra a despeito dos benefícios. Como não existe uma resposta correta neste caso, irei deixar aqui a minha opinião. Meu ponto de vista é que animais são necessários sim para pesquisa, ou em outras palavras: concordo em trocar o sofrimento de animais não humanos por informações que nos ajudem a compreender sistemas biológicos. Mas com uma grande ressalva: que o uso de animais seja bem planejado e bem feito. Já presenciei situações deploráveis de falta de planejamento e de controle no uso de animais em pesquisa, levando a gastos enormes de dinheiro público e a sofrimento desnecessário. Existem regulamentos e órgãos reguladores que objetivam o uso racional e a redução de sofrimento animal, que se seguidos (e se fizerem seu papel) resultam em ganho de qualidade de vida animal e dos resultados obtidos com eles.

Agora saindo do tema de animais utilizados em pesquisa e pensando de uma forma mais geral: já pararam para pensar na qualidade de vida dos vários tipos de animais usados por humanos para outros fins? Humanos têm uma péssima reputação quando consideramos a qualidade de vida de animais, sejam eles selvagens ou domesticados. Somos apontados como culpados por grandes massacres e como agentes de extinção de varias espécies. Somos naturalmente tão gananciosos e cruéis que entre a grande lista de espécies extinguidas por nós estão até mesmo nossos parentes mais próximos (outros hominídeos). De um primata onívoro sem significância na África saltamos de repente para o topo da cadeia alimentar e nossa dispersão pelo planeta trouxe uma onda de morte e destruição tão grande que o destino mais provável é que em breve nos extinguiremos também. Para quem quiser saber mais sobre nossa história e seu impacto no planeta recomendo um dos livros que mais me influenciou na vida: “Uma Breve Historia da Humanidade” escrito por Yuval Harari [11]. O autor também oferece um curso online gratuito pela plataforma Coursera e recomendo ambos (principalmente o curso, que é mais completo do que o livro) para qualquer Homo sapiens que esteja lendo este texto. Garanto que ninguém vai perder tempo lendo/ouvindo as discussões dele, que certamente mudarão a forma de ver o mundo de quem prestar atenção.

Um dos vários temas abordados pelo Harari é exatamente a qualidade de vida dos animais utilizados para satisfazer os humanos. Desde que nossa espécie começou a experimentar com uma vida sedentária e com a domesticação de plantas e animais, algumas espécies se tornaram muito numerosas. Por exemplo: Galinhas, porcos e bovinos (ou sua carne e derivados) são encontrados no mundo inteiro, e os “usamos” sem pensar muito de onde vieram e o que passaram para chegar ali. Pensando em números, vejam a Figura 2 abaixo. Em número de indivíduos existem 3,6 vezes mais animais domesticados no mundo do que humanos, e a biomassa (peso total) desses animais eh 2,3 vezes maior do que a de toda a humanidade  junta [12-14]!

Picture2

Figura 2: Estimativas da quantidade de animais no mundo. Em (a), total de indivíduos estimados para 2030. Em (b), biomassa total em toneladas.

Simplisticamente podemos pensar que esses animais estão melhores do que estariam na natureza. Vivem uma vida sem predadores (exceto quando os matamos no final, obviamente), com abrigo, alimento, com proteção a doenças e deixando um número muito maior de descendentes do que deixariam se estivessem livres. Mas não é bem assim. Mesmo provendo estes animais de tudo o que eles necessitam para ficarem vivos tempo suficiente até serem mortos para nossa conveniência, os ambientes artificiais onde eles são mantidos não fornecem os estímulos emocionais e sociais que eles necessitam para vidas plenas [12]. As condições de vida deles são miseráveis a ponto de fazer pessoas pararem de consumir produtos vindos destes animais ao presenciar parte do sistema. Espaços confinados, comida artificial, doenças degenerativas, densidades populacionais muito acima do normal, uma vida de gravidez (no caso da indústria do leite) e separação das crias constante, surtos de doenças e processos de abatimento prolongado são apenas alguns dos muitos sofrimentos aos quais eles são submetidos. Conseguimos suprir estes muitos bilhões de animais materialmente com tudo o que precisam: abrigo, comida, proteção (exceto contra nós mesmos). Mas os privamos de todas suas necessidades sociais, evolutivas e emocionais. E isto sem considerar nosso impacto para animais selvagens: seja pela morte direta através de caça ou morte indireta através de destruição de habitats ou introdução de doenças. O resultado disto tudo é sofrimento em uma escala nunca antes vista neste planeta, o que pode ser até considerado o pior crime já cometido pela humanidade [12]!

A primeira vista pode parecer contraditório pensar em uma sociedade cada vez mais atenta a valores éticos e morais permitir algo deste tipo. Mas outra característica muito importante para nós humanos é conseguir acreditar em contradições. E não estou sendo irônico, pois foi com essa habilidade que demos o passo além dos outros hominídeos e começamos a nossa dominação do mundo (novamente, leiam mais sobre isso no livro do Harari [11]). Então é perfeitamente plausível pensar em humanos completamente contra uso de animais de laboratório comendo carne com queijo em um churrasco, mesmo que o sofrimento dos bovinos que deram origem à comida deles seja igualável ou até maior do que eles querem evitar para os camundongos/coelhos/bodes/beagles/etc. A diferença está apenas no que o sofrimento resultou: alimento ou conhecimento para nossa espécie. Ou quantos de vocês começaram este texto achando um absurdo os maus tratos a animais pela Santa Cruz mas nunca pararam para pensar na vida que os animais de criação levam até serem sacrificados?

Então a mensagem final aqui é que o sofrimento animal faz parte da nossa cultura, quer que concordemos ou não. E que cada um traça uma linha (imaginária obviamente) separando o que é um absurdo do que é aceitável. Não existe uma saída fácil nem rápida, e para ser sincero a maior parte da humanidade nem deve achar que necessitamos de uma saída. Algumas pessoas acabam optando por parar de consumir qualquer produto de origem animal. Apesar de ser uma atitude “nobre”, isto não resolve o problema imediatamente. Afinal para cada um que toma esta atitude existem muitos outros Homo sapiens não se preocupando com esta questão. Sem contar que com o aumento do número de humanos no planeta a demanda de produção de alimento para suprir nossas necessidades aumentou. Consequentemente aumentou-se também a quantidade de animais domesticados e o tamanho das áreas de cultivo, resultando em mais sofrimento e mais impacto ambiental. O foco é quase sempre em produzir mais e se escuta bem pouco sobre produzir menos ou reduzir o consumo. Talvez isto seja esperado já que medidas de longo prazo não são muito bem vistas pelo sistema politico (pra que começar um projeto que vai dar resultados em 50 anos se ele não vai render votos no ano seguinte?), e políticas voltadas para redução de consumo ou controle de natalidade são impopulares. Mas algo precisa ser feito, seja pelo lado puramente voltado para ética e redução de sofrimento ou seja pelo lado mais egoísta de se querer evitar nossa extinção (se é que ainda dá tempo). Ao longo do tempo várias pessoas já chamaram a atenção para isto, e caso tivessem sido ouvidas nossa situação estaria bem melhor agora. Por exemplo, em 1959 Aldous Huxley já tratava do tema em seu livro “Regresso ao admirável mundo novo[15]. Quando o livro foi escrito a população humana era menos da metade do que é hoje, então não podemos pensar que demoramos demais a perceber o problema. Termino este texto então com as palavras dele: “Analisemos o problema da superpopulação. A quantidade sempre crescente de seres humanos pesa cada vez mais sobre os recursos naturais. O que fazer?

O que vocês acham disto tudo? Tem alguma resposta para a pergunta do Huxley? Sugestões ou querem discutir alguma coisa? Deixem comentários abaixo!


Referências:

[1]http://www.nature.com/news/us-government-issues-historic-3-5-million-fine-over-animal-welfare-1.19958
[2] https://awic.nal.usda.gov/government-and-professional-resources/federal-laws/animal-welfare-act
[3] http://ilarjournal.oxfordjournals.org/content/46/3/269.full
[4] https://www.thermofisher.com/fi/en/home/life-science/antibodies/custom-antibodies/custom-antibody-production/custom-polyclonal-antibody-production/custom-rabbit-polyclonal-antibody-production-protocols.html
[5] http://www.scbt.com/research/primary_antibodies_mammalian.html
[6] http://blogs.sciencemag.org/pipeline/archives/2016/05/23/trouble-at-santa-cruz-biotechnology
[7] https://www.glassdoor.com/Reviews/Santa-Cruz-Biotechnology-Reviews-E39955.htm
[8] http://www.newyorker.com/tech/elements/valuable-antibodies-at-a-high-cost
[9]http://www.nature.com/news/discovery-of-goat-facility-adds-to-antibody-provider-s-woes-1.12203
[10} http://www.nature.com/news/thousands-of-goats-and-rabbits-vanish-from-major-biotech-lab-1.19411
[11] Sapiens: Uma Breve História da Humanidade ; Yuval Noah Harari. http://www.ynharari.com/sapiens/short-overview/
[12] http://www.ynharari.com/ecology/articles/the-worst-crime-in-history/
[13] http://www.fao.org/docrep/005/y4252e/y4252e07.htm
[14] http://www.fao.org/english/newsroom/news/2002/7833-en.html
[15] Regresso ao Admirável Mundo Novo ; Aldous Huxley
Fonte das figuras: Wikimedia Commons (https://commons.wikimedia.org/), exceto para figura 1c (arquivo pessoal) e gráficos (feitos a partir de dados oficiais).

Sondando sequências proteicas como fontes para peptídeos antimicrobianos encriptados

Pessoal, depois de um longo e tenebroso inverno finalmente pude voltar a escrever para vocês. E não, não fui para a Finlândia visitar o Gabriel (embora quisesse muito), passar aquele friozinho no Norte da Europa. Estive terminando uma matéria muito puxada da Pós-graduação neste último mês e, como não sou robô para recarregar as minhas baterias na tomada, tive de tirar uns dias para descansar e arrumar minhas coisas para iniciar minha empreitada no Laboratório. Mas agora estou de volta: firme e forte. Então vamos ao que interessa. Vamos bater nosso papo sobre Ciência aqui, no Buteco da Biologia!!! Peguem uma breja (ou refri) geladinha(o)  e vamos lá.

Na matéria de hoje, vou explicar um pouco sobre o artigo científico publicado no período PLOS One em 2012 pelo grupo do pesquisador Carlos Bloch Jr. da Embrapa de Brasília e cujo título é este que encabeça esta matéria no nosso querido blog. O artigo Sondando sequências proteicas como fontes para peptídeos antimicrobianos encriptados (em inglês: Probing Protein Sequences as Sources for Encrypted Antimicrobial Peptides) descreve uma nova ferramenta de bioinformática, desenvolvida por este grupo da Embrapa, objetivando a descoberta de sequências de aminoácidos (os famosos peptídeos), escondidos no interior de proteínas de diversos organismos e que podem possuir atividade antimicrobiana [1].

Um dos objetivos deste trabalho ao desenvolver esta nova técnica (e testá-la) envolve a utilização de pequenos peptídeos com atividade antimicrobiana e que podem ter sua expressão aumentada na soja para prevenir que pragas possam dizimar as grandes plantações deste grão, tão importante à economia do Brasil. Assim, este tipo de tecnologia também entra no campo dos Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), embora difira dos organismos transgênicos por um aspecto muito simples: o material genético utilizado para aumentar a expressão de um dado peptídeo com atividade antimicrobiana está contido no DNA da soja (o organismo de origem) e não no DNA de um outro tipo de ser vivo. À este tipo de tecnologia dá-se o nome de INTRAGENIA ou CISGENIA. O artigo que abordaremos utiliza a primeira das duas metodologias citadas, mas, para clarificar melhor os conceitos, explicaremos de forma muito breve o que cada um significa e quais as vantagens (do ponto de vista ético) de sua utilização comparado aos transgênicos.

3-D_DNA

Figura 1 – Nos organismos geneticamente modificados (OGMs) é o DNA, que codifica para uma dada característica de interesse, que é inserido no genoma de um dado organismo receptor. Fonte: http://biology.about.com

 

Diversos autores propuseram definições para os termos CISGENIA INTRAGENIA. Contudo, nesta matéria, utilizaremos aquelas encontradas nos artigos publicados por Sticklen (2015) [2] e Holme et al (2013) [3], visto que foram apresentadas por tais autores após uma cuidadosa revisão da literatura científica sobre este tema. Assim sendo, CISGENIA é definido como a inserção no genoma de um dado organismo de um gene proveniente de um indivíduo da mesma espécie. Neste caso, tanto as sequências de DNA do gene que codificam para a proteína de interesse, quanto aquelas que não codificam (e que podem possuir funções de regulação da expressão) devem provir de um mesmo organismo. Já no caso da INTRAGENIA, o gene também é proveniente de um indivíduo da mesma espécie; entretanto, a porção codificante do gene pode originar de um indivíduo pertencente a uma dada variante da espécie, enquanto as regiões não codificantes podem vir de outras variantes desta espécie.

Ficou confuso??? Vamos exemplificar então, utilizando para isso um dos itens que tem mais sofrido com a inflação e que é base da alimentação dos brasileiros: o Feijão (Phaseolus vulgaris). O conjunto dos genes presentes em todos os tipos de feijão está representado na Figura 2a, mas vale lembrar que nem todas variantes de feijão possuem todos estes genes. Como nossos leitores devem saber, o Feijão Carioca apresenta várias manchinhas, cuja coloração varia de um marrom-escuro até o preto. Suponhamos que esta caráter seja codificado por um gene X e que queremos que as manchinhas passem a se fazer presentes no Feijão Branco. Se formos utilizar uma abordagem de CISGENIA, podemos pegar todo o gene X (Figura 2b) presente no Feijão Carioca e inseri-lo no genoma do Feijão Branco. Agora, vamos supor uma outra situação: digamos que queremos fazer com que as manchas marrons do Feijão Carioca desapareçam e sabemos que a expressão do gene X no seu genoma pode ser suprimida pelo gene Y presente no genoma do Feijão Branco. O único problema é que as regiões regulatórias do gene Y promovem uma expressão muito fraca da proteína por ele codificada. Assim, podemos retirar apenas a porção codificante do gene Y e colocarmos esta região sobre o controle das regiões regulatórias de genes altamente expressos; imaginemos que sejam as regiões regulatórias dos genes W e Z do Feijão Vermelho. Este tipo de abordagem, usada para eliminar as manchas do Feijão Carioca, condiz com o conceito de INTRAGENIA (Figura 2c).

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Figura 2 – Representação esquemática dos Cisgenes e Intragenes. (a) Conjunto dos genes existentes em uma dada espécie; vale lembrar que nem todos estes genes necessitam estar presentes em um único organismo, podendo haver variação entre as diferentes variantes da espécie. (b) Exemplo de um cisgene, no qual a totalidade do gene de interesse é inserido no genoma de um dado indivíduo. (c) Exemplos de intragenes, no qual diversas construções de genes, com segmentos de DNA originadas de distintos genes e/ou variantes, podem ser utilizadas para expressão de uma característica de interesse em um dado organismo. Fonte: Holme et al, 2013Plant Biotechnology Journal.

Após estas importantes explicações de um dos objetivos principais do artigo do qual vamos tratar, está mais do que na hora de discutirmos a seu respeito. Mas ATENÇÃO, recomendo que acessem as links (palavras em azul) os quais irei referenciar durante a explicação deste paper, visto que a partir daqui os termos podem se tornar um pouco nebulosos para aqueles que não estão familiarizados com a literatura científica. Então, vamos lá!!!

Logo de cara, o artigo escrito por Brand e colaboradores [1] inicia expondo qual será o alvo do trabalho de desenvolvimento do Kamal (a ferramenta de bioinformática que mencionei anteriormente): a busca por peptídeos encriptados (“escondidos”) e que estão escondidos no interior de proteínas que possuem alguma função conhecida. É curioso notar que estes peptídeos, liberados após a quebra das proteínas de onde se originam, também são funcionalmente ativos, vide os casos de peptídeos antimicrobianos presentes na pele dos sapos [4] e das hemorfinas, que são produzidas a partir da degradação da hemoglobina (a proteína de transporte de oxigênio no sangue) [5].

Tendo em vista estas propriedades de peptídeos encriptados, já descritos na literatura [4,5], e a grande disponibilidade de genomas descritos, os autores deste artigo se propuseram a desenvolver uma ferramenta computacional capaz de analisar as características físico-químicas de vários possíveis peptídeos encriptados no interior das proteínas de vários organismos e compará-los àqueles peptídeos antimicrobianos de função já conhecida. Esta ferramenta computacional, conhecida como Kamal, foi capaz de identificar 15 peptídeos que, juntamente com outras 11 sequências de peptídeos que ocorrem naturalmente, foram sintetizados quimicamente para averiguar os parâmetros biofísicos e sua interação com membranas biológicas simuladas. Caso estas duas características fossem, então, similares àquelas de peptídeos antimicrobianos encontrados na natureza, estes peptídeos encriptados seriam testados quanto à sua capacidade de combater algumas bactérias patogênicas, como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa Xanthomonas axonopodis. Assim sendo, os peptídeos que possuírem alguma atividade antimicrobiana passarão a ser conhecidos como peptídeos antimicrobianos intragênicos (cuja sigla em inglês é IAPs, de intragenic antimicrobial peptides).

Mas, como este software foi capaz de identificar quais possíveis peptídeos, escondidos no interior de proteínas de soja, possuíam semelhança com aqueles peptídeos antimicrobianos que ocorrem naturalmente na natureza? Em primeiro lugar, os autores buscaram alguns peptídeos com propriedades antimicrobianas (AMPs) encontradas no Banco de Dados Antimicrobial Peptide Database (APD) e, a partir das informações contidas no mesmo, compararam as características dos AMPs com aquelas calculadas para os IAPs. As principais características usadas para realizar tal comparação foram a hidrofobicidade (ou seja, a capacidade de interagir melhor com os lipídeos do que com a água), a carga dos peptídeos e sua estrutura. Estas propriedades foram selecionadas com base em achados da literatura científica que indica que tais peptídeos antimicrobianos promoveriam a morte dos microrganismos ao interagir com sua membrana plasmática, que é rica em uma classe de lipídeos que possuem, em uma de suas pontas, um grupo com carga elétrica ou neutro (porém, com uma polaridade, seja positiva ou negativa), conhecido como fosfolipídeos [6].

O software Kamal encontrou cerca de 500 IAPs com as características desejadas; contudo, como a ferramenta utilizada não pode garantir que todos possuem atividade antimicrobiana. Assim, 15 IAPs foram selecionados, aleatoriamente, para posterior caracterização de suas propriedades físico-químicas e se estes IAPs possuem, de fato, atividade antimicrobiana. Dentre os IAPs analisados, os resultados experimentais apontaram que IAPs com características mais hidrofóbicas e com uma estrutura específica (a alfa-hélice) interagiram de uma forma melhor com membranas, cujos lipídeos são eletricamente neutros. Além disso, estes lipídeos foram capazes de inibir o crescimento de microrganismos, como E. coli, P. aeruginosa, S. aureus X. axonopodis, indicando possuírem uma atividade antimicrobiana atacando tipos específicos de lipídeos da membrana destes micróbios.

Alpha_Helix

Figura 3 – Representação esquemática de uma alfa-hélice, um tipo de estrutura secundária formada pelos aminoácidos que integram um dado peptídeo. Fonte: http://chsibbio10-12.wikispaces.com/.

Diante destes resultados, os pesquisadores decidiram testar se IAPs, descobertos com esta ferramenta de bioinformática, poderiam ser aplicados como fonte de genes para técnicas de intragenia. Deste modo, dois peptídeos, encontrados no interior das proteínas flavonóide-3-hidroxilase lipoato-proteína ligase B, ambas encontradas na soja (Glycine max), foram utilizados para testar seu potencial em prevenir a disseminação  e infecção dos esporos de Phakospsora pachyrhizi, o fungo causador da Ferrugem Asiática da Soja, na superfície das folhas. Como mostrado na Figura 4, ambos peptídeos foram capazes de inibir o crescimento da Ferrugem Asiática em comparação ao organismo controle (não tratado com nenhum peptídeo). Este resultado indica que, embora o software Kamal não seja capaz de predizer com 100% de certeza se um dado IAP possuirá atividade antimicrobiana, ele pode ser utilizado como uma ferramenta capaz de filtrar, entre a gigantesca quantidade de proteínas existente nos organismos, aqueles poucos peptídeos encriptados que, eventualmente, podem ser importantes candidatos a serem utilizados para combater determinados micróbios.

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Figura 4 – Os peptídeos encontrados nas proteínas Flavonóide-3-hidroxilase (Peptídeo 1) e Lipoato-proteína ligase B (Peptídeo 2) possuem atividade antimicrobiana capaz de proteger as plantas de soja da infecção com o fungo da Ferrugem Asiática. A esquerda está indicado a concentração de peptídos utilizado em cada experimento. Adaptado de: Brand et al (2013).

 

É interessante notar a história desenvolvida neste artigo. A ferramenta de bioinformática Kamal utiliza de conhecimentos de Bioquímica e Biofísica para tentar desvendar os possíveis peptídeos que podem ser utilizados em técnicas de intragenia. Isto apresenta uma grande vantagem do ponto de vista agrícola (não a toa o trabalho foi desenvolvido na EMBRAPA e o modelo de estudo é a soja). Há muito tempo, a utilização da tecnologia dos transgênicos tem sido feita de modo a aumentar a produtividade das lavouras e a resistências das plantações a diversas pragas e condições ambientais adversas [3].

Contudo, aspectos éticos contra a utilização desta tecnologia vêm sendo levantados pela sociedade, como discutido pelo filósofo Bjørn Myskja [7]. Este filósofo discute que parte dela rejeita os transgênicos, seja por uma crença no poder de um ser superior e criador que não pode ser replicado pelo homem (ou seja, os transgênicos seriam “brincar de Deus”), seja porque parte da sociedade acredita que a introdução de genes de uma espécie em outra completamente distinta cruza a barreira interespecífica e que isto não é natural. Sob esta perspectiva, as técnicas de cisgenia e intragenia, como a abordada nesta matéria do blog, viriam a calhar, pois os genes que iriam ser expressos em um dado organismo originar-se-iam de um indivíduo proveniente da mesma espécie.

Além disso, sob o aspecto ambiental, a descoberta de peptídeos antimicrobianos (os IAPs), existentes no genoma do próprio organismo, poderiam ser utilizados para aumentar a produtividade das lavouras (por reduzir as perdas com pragas agrícolas), reduzindo a área de terras utilizadas para plantio, bem como o uso de agrotóxicos nas plantações e que podem prejudicar a saúde dos consumidores.

E vocês, o que pensam sobre o uso da tecnologia dos intragênicos nas propriedades agrícolas? Existe alguma grande vantagem em relação aos transgênicos? Mais ainda, o que vocês pensam da tecnologia dos transgênicos? Particularmente, não creio que exista dilema moral na sua utilização, mas gostaria de saber se vocês concordam ou não comigo.

Deixem a opinião de vocês nos comentários e muito obrigado por curtirem mais esta matéria aqui, no nosso Buteco da Biologia!!!!!!


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] BRAND, G. D. et al. Probing Protein Sequences as Sources for Encrypted Antimicrobial Peptides. PLoS ONE, v. 7, n. 9, p. e45848, 2012.
[2] STICKLEN, M. Transgenic , Cisgenic , Intragenic and Subgenic Crops. Advances in Crop Science and Technology, v. 3, n. 2, p. 2–3, 2015.
[3] HOLME, I. B.; WENDT, T.; HOLM, P. B. Intragenesis and cisgenesis as alternatives to transgenic crop development. Plant Biotechnology Journal, v. 11, p. 395–407, 2013.
[4] VANHOYE, D. et al. Antimicrobial peptides from hylid and ranin frogs originated from a 150-million-year-old ancestral precursor with a conserved signal peptide but a hypermutable antimicrobial domain. European Journal of Biochemistry, v. 270, p. 2068–2081, 2003.
[5] ZHAO, Q. et al. Opioid Peptides Derived from Hemoglobin : Hemorphins. Biopolymers, v. 43, n. 2, p. 75–98, 1997.
[6] ZASLOFF, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature, v. 415, n. January, p. 389–395, 2002.
[7] MYSKJA, B. K. The moral difference between intragenic and transgenic modification of plants. Journal of Agricultural and Environmental Ethics, v. 19, p. 225–238, 2006.