Sondando sequências proteicas como fontes para peptídeos antimicrobianos encriptados

Pessoal, depois de um longo e tenebroso inverno finalmente pude voltar a escrever para vocês. E não, não fui para a Finlândia visitar o Gabriel (embora quisesse muito), passar aquele friozinho no Norte da Europa. Estive terminando uma matéria muito puxada da Pós-graduação neste último mês e, como não sou robô para recarregar as minhas baterias na tomada, tive de tirar uns dias para descansar e arrumar minhas coisas para iniciar minha empreitada no Laboratório. Mas agora estou de volta: firme e forte. Então vamos ao que interessa. Vamos bater nosso papo sobre Ciência aqui, no Buteco da Biologia!!! Peguem uma breja (ou refri) geladinha(o)  e vamos lá.

Na matéria de hoje, vou explicar um pouco sobre o artigo científico publicado no período PLOS One em 2012 pelo grupo do pesquisador Carlos Bloch Jr. da Embrapa de Brasília e cujo título é este que encabeça esta matéria no nosso querido blog. O artigo Sondando sequências proteicas como fontes para peptídeos antimicrobianos encriptados (em inglês: Probing Protein Sequences as Sources for Encrypted Antimicrobial Peptides) descreve uma nova ferramenta de bioinformática, desenvolvida por este grupo da Embrapa, objetivando a descoberta de sequências de aminoácidos (os famosos peptídeos), escondidos no interior de proteínas de diversos organismos e que podem possuir atividade antimicrobiana [1].

Um dos objetivos deste trabalho ao desenvolver esta nova técnica (e testá-la) envolve a utilização de pequenos peptídeos com atividade antimicrobiana e que podem ter sua expressão aumentada na soja para prevenir que pragas possam dizimar as grandes plantações deste grão, tão importante à economia do Brasil. Assim, este tipo de tecnologia também entra no campo dos Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), embora difira dos organismos transgênicos por um aspecto muito simples: o material genético utilizado para aumentar a expressão de um dado peptídeo com atividade antimicrobiana está contido no DNA da soja (o organismo de origem) e não no DNA de um outro tipo de ser vivo. À este tipo de tecnologia dá-se o nome de INTRAGENIA ou CISGENIA. O artigo que abordaremos utiliza a primeira das duas metodologias citadas, mas, para clarificar melhor os conceitos, explicaremos de forma muito breve o que cada um significa e quais as vantagens (do ponto de vista ético) de sua utilização comparado aos transgênicos.

3-D_DNA

Figura 1 – Nos organismos geneticamente modificados (OGMs) é o DNA, que codifica para uma dada característica de interesse, que é inserido no genoma de um dado organismo receptor. Fonte: http://biology.about.com

 

Diversos autores propuseram definições para os termos CISGENIA INTRAGENIA. Contudo, nesta matéria, utilizaremos aquelas encontradas nos artigos publicados por Sticklen (2015) [2] e Holme et al (2013) [3], visto que foram apresentadas por tais autores após uma cuidadosa revisão da literatura científica sobre este tema. Assim sendo, CISGENIA é definido como a inserção no genoma de um dado organismo de um gene proveniente de um indivíduo da mesma espécie. Neste caso, tanto as sequências de DNA do gene que codificam para a proteína de interesse, quanto aquelas que não codificam (e que podem possuir funções de regulação da expressão) devem provir de um mesmo organismo. Já no caso da INTRAGENIA, o gene também é proveniente de um indivíduo da mesma espécie; entretanto, a porção codificante do gene pode originar de um indivíduo pertencente a uma dada variante da espécie, enquanto as regiões não codificantes podem vir de outras variantes desta espécie.

Ficou confuso??? Vamos exemplificar então, utilizando para isso um dos itens que tem mais sofrido com a inflação e que é base da alimentação dos brasileiros: o Feijão (Phaseolus vulgaris). O conjunto dos genes presentes em todos os tipos de feijão está representado na Figura 2a, mas vale lembrar que nem todas variantes de feijão possuem todos estes genes. Como nossos leitores devem saber, o Feijão Carioca apresenta várias manchinhas, cuja coloração varia de um marrom-escuro até o preto. Suponhamos que esta caráter seja codificado por um gene X e que queremos que as manchinhas passem a se fazer presentes no Feijão Branco. Se formos utilizar uma abordagem de CISGENIA, podemos pegar todo o gene X (Figura 2b) presente no Feijão Carioca e inseri-lo no genoma do Feijão Branco. Agora, vamos supor uma outra situação: digamos que queremos fazer com que as manchas marrons do Feijão Carioca desapareçam e sabemos que a expressão do gene X no seu genoma pode ser suprimida pelo gene Y presente no genoma do Feijão Branco. O único problema é que as regiões regulatórias do gene Y promovem uma expressão muito fraca da proteína por ele codificada. Assim, podemos retirar apenas a porção codificante do gene Y e colocarmos esta região sobre o controle das regiões regulatórias de genes altamente expressos; imaginemos que sejam as regiões regulatórias dos genes W e Z do Feijão Vermelho. Este tipo de abordagem, usada para eliminar as manchas do Feijão Carioca, condiz com o conceito de INTRAGENIA (Figura 2c).

imagem

Figura 2 – Representação esquemática dos Cisgenes e Intragenes. (a) Conjunto dos genes existentes em uma dada espécie; vale lembrar que nem todos estes genes necessitam estar presentes em um único organismo, podendo haver variação entre as diferentes variantes da espécie. (b) Exemplo de um cisgene, no qual a totalidade do gene de interesse é inserido no genoma de um dado indivíduo. (c) Exemplos de intragenes, no qual diversas construções de genes, com segmentos de DNA originadas de distintos genes e/ou variantes, podem ser utilizadas para expressão de uma característica de interesse em um dado organismo. Fonte: Holme et al, 2013Plant Biotechnology Journal.

Após estas importantes explicações de um dos objetivos principais do artigo do qual vamos tratar, está mais do que na hora de discutirmos a seu respeito. Mas ATENÇÃO, recomendo que acessem as links (palavras em azul) os quais irei referenciar durante a explicação deste paper, visto que a partir daqui os termos podem se tornar um pouco nebulosos para aqueles que não estão familiarizados com a literatura científica. Então, vamos lá!!!

Logo de cara, o artigo escrito por Brand e colaboradores [1] inicia expondo qual será o alvo do trabalho de desenvolvimento do Kamal (a ferramenta de bioinformática que mencionei anteriormente): a busca por peptídeos encriptados (“escondidos”) e que estão escondidos no interior de proteínas que possuem alguma função conhecida. É curioso notar que estes peptídeos, liberados após a quebra das proteínas de onde se originam, também são funcionalmente ativos, vide os casos de peptídeos antimicrobianos presentes na pele dos sapos [4] e das hemorfinas, que são produzidas a partir da degradação da hemoglobina (a proteína de transporte de oxigênio no sangue) [5].

Tendo em vista estas propriedades de peptídeos encriptados, já descritos na literatura [4,5], e a grande disponibilidade de genomas descritos, os autores deste artigo se propuseram a desenvolver uma ferramenta computacional capaz de analisar as características físico-químicas de vários possíveis peptídeos encriptados no interior das proteínas de vários organismos e compará-los àqueles peptídeos antimicrobianos de função já conhecida. Esta ferramenta computacional, conhecida como Kamal, foi capaz de identificar 15 peptídeos que, juntamente com outras 11 sequências de peptídeos que ocorrem naturalmente, foram sintetizados quimicamente para averiguar os parâmetros biofísicos e sua interação com membranas biológicas simuladas. Caso estas duas características fossem, então, similares àquelas de peptídeos antimicrobianos encontrados na natureza, estes peptídeos encriptados seriam testados quanto à sua capacidade de combater algumas bactérias patogênicas, como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa Xanthomonas axonopodis. Assim sendo, os peptídeos que possuírem alguma atividade antimicrobiana passarão a ser conhecidos como peptídeos antimicrobianos intragênicos (cuja sigla em inglês é IAPs, de intragenic antimicrobial peptides).

Mas, como este software foi capaz de identificar quais possíveis peptídeos, escondidos no interior de proteínas de soja, possuíam semelhança com aqueles peptídeos antimicrobianos que ocorrem naturalmente na natureza? Em primeiro lugar, os autores buscaram alguns peptídeos com propriedades antimicrobianas (AMPs) encontradas no Banco de Dados Antimicrobial Peptide Database (APD) e, a partir das informações contidas no mesmo, compararam as características dos AMPs com aquelas calculadas para os IAPs. As principais características usadas para realizar tal comparação foram a hidrofobicidade (ou seja, a capacidade de interagir melhor com os lipídeos do que com a água), a carga dos peptídeos e sua estrutura. Estas propriedades foram selecionadas com base em achados da literatura científica que indica que tais peptídeos antimicrobianos promoveriam a morte dos microrganismos ao interagir com sua membrana plasmática, que é rica em uma classe de lipídeos que possuem, em uma de suas pontas, um grupo com carga elétrica ou neutro (porém, com uma polaridade, seja positiva ou negativa), conhecido como fosfolipídeos [6].

O software Kamal encontrou cerca de 500 IAPs com as características desejadas; contudo, como a ferramenta utilizada não pode garantir que todos possuem atividade antimicrobiana. Assim, 15 IAPs foram selecionados, aleatoriamente, para posterior caracterização de suas propriedades físico-químicas e se estes IAPs possuem, de fato, atividade antimicrobiana. Dentre os IAPs analisados, os resultados experimentais apontaram que IAPs com características mais hidrofóbicas e com uma estrutura específica (a alfa-hélice) interagiram de uma forma melhor com membranas, cujos lipídeos são eletricamente neutros. Além disso, estes lipídeos foram capazes de inibir o crescimento de microrganismos, como E. coli, P. aeruginosa, S. aureus X. axonopodis, indicando possuírem uma atividade antimicrobiana atacando tipos específicos de lipídeos da membrana destes micróbios.

Alpha_Helix

Figura 3 – Representação esquemática de uma alfa-hélice, um tipo de estrutura secundária formada pelos aminoácidos que integram um dado peptídeo. Fonte: http://chsibbio10-12.wikispaces.com/.

Diante destes resultados, os pesquisadores decidiram testar se IAPs, descobertos com esta ferramenta de bioinformática, poderiam ser aplicados como fonte de genes para técnicas de intragenia. Deste modo, dois peptídeos, encontrados no interior das proteínas flavonóide-3-hidroxilase lipoato-proteína ligase B, ambas encontradas na soja (Glycine max), foram utilizados para testar seu potencial em prevenir a disseminação  e infecção dos esporos de Phakospsora pachyrhizi, o fungo causador da Ferrugem Asiática da Soja, na superfície das folhas. Como mostrado na Figura 4, ambos peptídeos foram capazes de inibir o crescimento da Ferrugem Asiática em comparação ao organismo controle (não tratado com nenhum peptídeo). Este resultado indica que, embora o software Kamal não seja capaz de predizer com 100% de certeza se um dado IAP possuirá atividade antimicrobiana, ele pode ser utilizado como uma ferramenta capaz de filtrar, entre a gigantesca quantidade de proteínas existente nos organismos, aqueles poucos peptídeos encriptados que, eventualmente, podem ser importantes candidatos a serem utilizados para combater determinados micróbios.

resultado

Figura 4 – Os peptídeos encontrados nas proteínas Flavonóide-3-hidroxilase (Peptídeo 1) e Lipoato-proteína ligase B (Peptídeo 2) possuem atividade antimicrobiana capaz de proteger as plantas de soja da infecção com o fungo da Ferrugem Asiática. A esquerda está indicado a concentração de peptídos utilizado em cada experimento. Adaptado de: Brand et al (2013).

 

É interessante notar a história desenvolvida neste artigo. A ferramenta de bioinformática Kamal utiliza de conhecimentos de Bioquímica e Biofísica para tentar desvendar os possíveis peptídeos que podem ser utilizados em técnicas de intragenia. Isto apresenta uma grande vantagem do ponto de vista agrícola (não a toa o trabalho foi desenvolvido na EMBRAPA e o modelo de estudo é a soja). Há muito tempo, a utilização da tecnologia dos transgênicos tem sido feita de modo a aumentar a produtividade das lavouras e a resistências das plantações a diversas pragas e condições ambientais adversas [3].

Contudo, aspectos éticos contra a utilização desta tecnologia vêm sendo levantados pela sociedade, como discutido pelo filósofo Bjørn Myskja [7]. Este filósofo discute que parte dela rejeita os transgênicos, seja por uma crença no poder de um ser superior e criador que não pode ser replicado pelo homem (ou seja, os transgênicos seriam “brincar de Deus”), seja porque parte da sociedade acredita que a introdução de genes de uma espécie em outra completamente distinta cruza a barreira interespecífica e que isto não é natural. Sob esta perspectiva, as técnicas de cisgenia e intragenia, como a abordada nesta matéria do blog, viriam a calhar, pois os genes que iriam ser expressos em um dado organismo originar-se-iam de um indivíduo proveniente da mesma espécie.

Além disso, sob o aspecto ambiental, a descoberta de peptídeos antimicrobianos (os IAPs), existentes no genoma do próprio organismo, poderiam ser utilizados para aumentar a produtividade das lavouras (por reduzir as perdas com pragas agrícolas), reduzindo a área de terras utilizadas para plantio, bem como o uso de agrotóxicos nas plantações e que podem prejudicar a saúde dos consumidores.

E vocês, o que pensam sobre o uso da tecnologia dos intragênicos nas propriedades agrícolas? Existe alguma grande vantagem em relação aos transgênicos? Mais ainda, o que vocês pensam da tecnologia dos transgênicos? Particularmente, não creio que exista dilema moral na sua utilização, mas gostaria de saber se vocês concordam ou não comigo.

Deixem a opinião de vocês nos comentários e muito obrigado por curtirem mais esta matéria aqui, no nosso Buteco da Biologia!!!!!!


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] BRAND, G. D. et al. Probing Protein Sequences as Sources for Encrypted Antimicrobial Peptides. PLoS ONE, v. 7, n. 9, p. e45848, 2012.
[2] STICKLEN, M. Transgenic , Cisgenic , Intragenic and Subgenic Crops. Advances in Crop Science and Technology, v. 3, n. 2, p. 2–3, 2015.
[3] HOLME, I. B.; WENDT, T.; HOLM, P. B. Intragenesis and cisgenesis as alternatives to transgenic crop development. Plant Biotechnology Journal, v. 11, p. 395–407, 2013.
[4] VANHOYE, D. et al. Antimicrobial peptides from hylid and ranin frogs originated from a 150-million-year-old ancestral precursor with a conserved signal peptide but a hypermutable antimicrobial domain. European Journal of Biochemistry, v. 270, p. 2068–2081, 2003.
[5] ZHAO, Q. et al. Opioid Peptides Derived from Hemoglobin : Hemorphins. Biopolymers, v. 43, n. 2, p. 75–98, 1997.
[6] ZASLOFF, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature, v. 415, n. January, p. 389–395, 2002.
[7] MYSKJA, B. K. The moral difference between intragenic and transgenic modification of plants. Journal of Agricultural and Environmental Ethics, v. 19, p. 225–238, 2006.

 

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